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小鼠Runt相關轉(zhuǎn)錄因子2 (RUNX2)試劑盒說明書

發(fā)布時間:2015-01-19瀏覽:1540次

小鼠Runt相關轉(zhuǎn)錄因子2 (RUNX2)試劑盒說明書

                                                                                                        (本試劑盒僅供體外研究使用、不用于臨床診斷!

試劑盒組成:

名稱-中文

名稱-英文

規(guī)格

保存條件

ELISA酶標板

Micro ELISA Plate

8×12 / 8×6*

4

凍干標準品

Reference Standard

2/ 1*

4

標準品&樣品稀釋液

Reference Standard & Sample Diluent

1  20mL/12mL*

4

濃縮生物素化抗體    

Concentrated Biotinylated Detection Ab

1  120μL/70μL*

4

生物素化抗體稀釋液  

Diluent for Biotinylated Detection Ab

1  10mL/6mL*

4

濃縮HRP酶結(jié)合物    

Concentrated HRP Conjugate

1  120μL/70μL*

4(避光)

酶結(jié)合物稀釋液      

Diluent for HRP Conjugate

1  10mL/6mL* 

4

濃縮洗滌液25×   

Concentrated Wash Buffer 25×

1  30mL/16mL*

4

底物溶液TMB    

Substrate Reagent

1  10mL/6mL*

4(避光)

反應終止液         

Stop Solution

1  10mL/6mL*

4

封板覆膜

Plate Sealer

5/3*


產(chǎn)品說明書

Product Description

1


*: [96T/48T](打開包裝后請及時檢查所有物品是否齊全完整)






檢測原理:

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法。用抗小鼠RUNX2抗體包被于酶標板上,實驗時標本或標準品中的RUNX2會與包被抗體結(jié)合,游離的成分被洗去。依次加入生物素化的抗小鼠RUNX2抗體和辣根過氧化物酶標記的親和素。抗小鼠RUNX2抗體與結(jié)合在包被抗體上的小鼠RUNX2結(jié)合、生物素與親和素特異性結(jié)合而形成免疫復合物,游離的成分被洗去。加入顯色底物(TMB),TMB在辣根過氧化物酶的催化下現(xiàn)藍色,加終止液后變黃。用酶標儀在450nm波長處測OD值,RUNX2濃度與OD450值之間呈正比,通過繪制標準曲線求出標本中RUNX2的濃度。


標本收集:

1.       血清:全血標本于室溫放置2小時或4℃置夜后于1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測,收集血液的試管應為一次性的無熱原,無內(nèi)毒素試管。

2.       血漿:抗凝劑推薦使用EDTA.Na2標本采集后30分鐘內(nèi)于1000×g離心15分鐘,取上清即可檢測。避免使用溶血,高血脂標本。

3.       組織勻漿:用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,以去除殘留血液(勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結(jié)果),稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS(一般按1:9的重量體積比,比如1g的組織樣本對應9mLPBS,具體體積可根據(jù)實驗需要適當調(diào)整,并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中,于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞,可以對勻漿液進行超聲破碎,或反復凍融。zui后將勻漿液于5000×g 離心5~10分鐘,取上清檢測。

4.       細胞培養(yǎng)上清:取細胞培養(yǎng)上清于1000×g離心20分鐘,除去雜質(zhì)及細胞碎片。取上清檢測。

5.       其它生物標本:1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測

(具體處理方法可參考:http://www.elabscience。。cn/news2.asp?tid=477

6.       標本應清澈透明,懸浮物應離心去除。

7.       標本收集后若不及時檢測,請按一次使用量分裝,凍存于-20/-80冰箱內(nèi),避免反復凍融,1-6月內(nèi)檢測,4保存的應在1周內(nèi)進行檢測。

8.       如果您的樣本中檢測物濃度高于標準品zui高值,請根據(jù)實際情況,做適當倍數(shù)稀釋(建議先做預實驗,以確定稀釋倍數(shù))。


試驗所需自備物品:

  1. 酶標儀(450nm波長濾光片)
  2. 高精度移液器,EP管及一次性吸頭0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL
  3. 37恒溫箱, 雙蒸水或去離子水
  4. 吸水紙


檢測前準備工作:

  1. 請?zhí)崆?/span>20分鐘從冰箱中取出試劑盒,平衡至室溫。
  2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回4。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶,屬于正常現(xiàn)象,可用40水浴微加熱使結(jié)晶*溶解后再配制洗滌液(加熱溫度不要超過50,使用時洗滌液應為室溫)。
  3. 標準品: 加入標準品&樣品稀釋液1.0mL至凍干標準品中,靜置10分鐘,待其充分溶解后,輕輕混勻(濃度為20ng/mL)。然后根據(jù)需要進行倍比稀釋(注:不要直接在反應孔中進行倍比稀釋)。建議配制成以下濃度: 2010、5、2.5、1.25、0.63、0.310 ng/mL ,樣品稀釋液直接作為空白孔0ng/mL。如配制10ng/mL標準品:取0.5mL 20ng/mL的上述標準品加入含有0.5mL樣品稀釋液的EP管中,混勻即可,其余濃度依此類推。
  4. 生物素化抗體工作液:實驗前計算當次實驗所需用量(以100μL/孔計),實際配制時應多配制100-200μL。使用前15分鐘,以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:100)成工作濃度。當日使用。
    1. 酶結(jié)合物工作液:實驗前計算當次實驗所需用量(以100μL/孔計),實際配制時應多配制  100-200μL。使用前15分鐘,以酶結(jié)合物稀釋液稀釋濃縮HRP酶結(jié)合物(1:100)成工作濃度。當日使用。

洗滌方法:

  1. 自動洗板機:每孔加入洗滌液350μL,注入與吸出間隔60秒。
  2. 手工洗板:甩盡孔內(nèi)液體,在潔凈的吸水紙上拍干,每孔加洗滌液350μL浸泡1-2分鐘,吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內(nèi)的液體,在厚的吸水紙上拍干。


操作步驟:

實驗開始前,各試劑均應平衡至室溫;試劑或樣品配制時,均需充分混勻,并盡量避免起泡。

  1. 加樣:分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔??瞻卓准訕悠废♂屢?/span>100μL,余孔分別加標準品或待測樣品100μL,注意不要有氣泡,加樣時將樣品加于酶標板底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。給酶標板覆膜,37孵育90分鐘。為保證實驗結(jié)果有效性,每次實驗請使用新的標準品溶液。
  2. 棄去液體,甩干,不用洗滌。每個孔中加入生物素化抗體工作液100μL(在使用前15分鐘內(nèi)配制),酶標板加上覆膜,37溫育1小時。
  3. 棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板 3次,每次浸泡1-2分鐘,大約350μL/每孔,甩干并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干。
  4. 每孔加酶結(jié)合物工作液(臨用前15分鐘內(nèi)配制)100μL,加上覆膜,37溫育30分鐘
  5. 棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板5次,方法同步驟3。
  6. 每孔加底物溶液(TMB)100μL,酶標板加上覆膜37避光孵育15分鐘左右(根據(jù)實際顯色情況酌情縮短或延長,但不可超過30分鐘。當標準孔出現(xiàn)明顯梯度時,即可終止)。
  7. 每孔加終止液50μL,終止反應,此時藍色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。
  8. 立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度(OD值)。應提前打開酶標儀電源,預熱儀器,設置好檢測程序。
  9. 實驗完畢后將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回冰箱保存。


注意事項:

  1. 保存:試劑盒中各試劑請按說明書提示合理存放。在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須旋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染,否則可能會出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。
  1. 酶標板:剛開啟的酶標板孔中可能會有少許水樣物質(zhì),此為正常現(xiàn)象,不會對實驗結(jié)果造成任何影響。
  2. 加樣:加樣或加試劑時,*個孔與zui后一個孔的加樣時間間隔如果太大,將會導致不同的預溫育"時間,從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。每次的加樣時間控制在10分鐘內(nèi)。推薦設置復孔。
  3. 溫育:為防止樣品蒸發(fā),實驗時必須給酶標板覆膜;洗板后應盡快進行下步操作,避免酶標板處于干燥狀態(tài);嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。
  4. 洗滌:洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在吸水紙上拍干,勿將濾紙直接放入反應孔中吸水。在讀數(shù)前要注意清除底部殘留的液體和手指印,以免影響酶標儀讀數(shù)。
  5. 試劑配制:Concentrated Biotinylated Detection AbConcentrated HRP Conjugate體積較小,運輸過程會使液體沾到管壁或瓶蓋,因此使用前1000轉(zhuǎn)/分離心1min,以使附著管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。取用前,請用移液器小心吹打4-5次使溶液混勻。標準品、生物素化抗體工作液、酶結(jié)合物工作液請根據(jù)所需用量配制,并使用相應的稀釋液配制,不能混淆。請配制標準品及工作液,盡量不要微量配制(如吸取Concentrated Biotinylated Detection Ab時,一次不要小于10μL),以避免由于不準確稀釋而造成濃度誤差;請勿重復使用已稀釋過的標準品、生物素化抗體工作液、酶結(jié)合物工作液。若需要分次使用標準品應按照每一次用量分裝,將其放在-20-80貯存。避免反復凍融。
  6. 顯色時間的控制:加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化(比如每隔5分鐘),如梯度已很明顯,請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應,避免顏色過深影響酶標儀讀數(shù)。
  7. 底物:底物請避光保存,在儲存和溫育時避免強光直接照射。
  8. 混勻:充分輕微混勻?qū)Ψ磻Y(jié)果尤為重要,使用微量振蕩器(使用zui低頻率),如無微量振蕩器,可在反應前手工輕輕敲擊酶標板框混勻。
  9. 安全:試驗中請穿著實驗服并帶乳膠手套做好防護工作。特別是檢測血液或者其他體液標本時,請按國家生物試驗室安全防護條例執(zhí)行。
  10. 不同批號的試劑盒組份不能混用(洗滌液和反應終止液除外)
  11. 試驗中所用的EP管和吸頭均為一次性使用,嚴禁混用,否則將影響試驗結(jié)果!


結(jié)果判斷:

  1. 每個標準品的OD值減去空白孔的OD后作圖,如設置復孔,則應取其平均值計算。以標準品的濃度為橫坐標,OD值為縱坐標,繪出標準曲線。亦可以OD值為橫坐標,標準品的濃度為縱坐標,繪出標準曲線。
  2. 推薦使用專業(yè)的曲線制作軟件,如curve expert 1.3,在軟件界面既可根據(jù)樣品OD值,由標準曲線查出相應的濃度,乘以稀釋倍數(shù);亦可將樣品的OD值代入標準曲線的擬合方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實際濃度。
  3. 若標本OD值高于標準曲線上限,應適當稀釋后重測,計算濃度時應乘以稀釋倍數(shù)。


靈敏度、檢測范圍、特異性和重復性:

靈敏度:zui小可測0.19ng/mL

檢測范圍:0.31 – 20ng/mL。

特異性:可檢測重組或天然的小鼠RUNX2,且與其它相關蛋白無交叉反應。

重復性:板內(nèi),板間變異系數(shù)均<10%。

問題分析

問題描述

可能原因

相應對策

標準曲線梯度差

吸液或加液不準

檢查移液器及吸頭

標準品稀釋不正確

溶解標準品時稍微旋轉(zhuǎn)瓶身,輕輕混勻使粉末*溶解

洗滌不*

保證洗滌時間和洗滌次數(shù)及每孔的加液量

顯色很弱或無色

孵育時間太短

保證充足的孵育時間

實驗溫度不正確

使用推薦的實驗溫度

試劑體積不夠或漏加

檢查吸液及加液過程,保證所有試劑按順序足量添加

稀釋不正確

讀數(shù)數(shù)值低

酶標儀設置不正確


在酶標儀上檢查波長及濾光片設置

提前打開酶標儀預熱

曲線偏差

加液不正確

檢查加液情況

背景值

檢測抗體的工作濃度過高

使用推薦的稀釋倍數(shù)

酶標板洗滌不*

重新閱讀操作手冊,保證清洗*;如果用自動洗板機,請檢查所有的出口是否有堵塞

洗液有污染

配制新鮮的洗液

靈敏度低

ELISA試劑盒保存不當

按說明書要求保存相關試劑

讀數(shù)前未終止

OD讀數(shù)前應在每孔中加入終止液

    

說明

  1. 限于現(xiàn)有條件及科學技術水平,尚不能對所有原料進行全面的鑒定分析,本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術風險。
  2. zui終的實驗結(jié)果與試劑的有效性、實驗者的相關操作以及當時的實驗環(huán)境密切相關,請務必準備充足的待測樣品。
  3. 只有全部使用ElabTM試劑才能保證檢測效果,不能混用其他制造商的產(chǎn)品。只有嚴格遵守ElabTM試劑的實驗說明才會得到*的檢測結(jié)果。
  4. 有效期:6個月。
  5. 本操作說明同樣適用于48T試劑盒。


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